Виды ферментов и их функции. Энзимы – польза ферментов в питании

В клетке любого живого организма протекают миллионы химических реакций. Каждая из них имеет большое значение, поэтому важно поддерживать скорость биологических процессов на высоком уровне. Почти каждая реакция катализируется своим ферментом. Что такое ферменты? Какова их роль в клетке?

Ферменты. Определение

Термин "фермент" происходит от латинского fermentum - закваска. Также они могут называться энзимами от греческого en zyme - "в дрожжах".

Ферменты - биологически активные вещества, поэтому любая реакция, протекающая в клетке, не обходится без их участия. Эти вещества выполняют роль катализаторов. Соответственно, любой фермент обладает двумя основными свойствами:

1) Энзим ускоряет биохимическую реакцию, но при этом не расходуется.

2) Величина константы равновесия не меняется, а лишь ускоряется достижение этого значения.

Ферменты ускоряют биохимические реакции в тысячу, а в некоторых случаях в миллион раз. Это значит, что при отсутствии ферментативного аппарата все внутриклеточные процессы практически остановятся, а сама клетка погибнет. Поэтому роль ферментов как биологически активных веществ велика.

Разнообразие энзимов позволяет разносторонне регулировать метаболизм клетки. В любом каскаде реакций принимает участие множество ферментов различных классов. Биологические катализаторы обладают большой избирательностью благодаря определенной конформации молекулы. Т. к. энзимы в большинстве случаев имеют белковую природу, они находятся в третичной или четвертичной структуре. Объясняется это опять же специфичностью молекулы.

Функции энзимов в клетке

Главная задача фермента - ускорение соответствующей реакции. Любой каскад процессов, начиная с разложения пероксида водорода и заканчивая гликолизом, требует присутствия биологического катализатора.

Правильная работа ферментов достигается высокой специфичностью к определенному субстрату. Это значит, что катализатор может ускорять только определенную реакцию и никакую больше, даже очень похожую. По степени специфичности выделяют следующие группы энзимов:

1) Ферменты с абсолютной специфичностью, когда катализируется только одна-единственная реакция. Например, коллагеназа расщепляет коллаген, а мальтаза расщепляет мальтозу.

2) Ферменты с относительной специфичностью. Сюда входят такие вещества, которые могут катализировать определенный класс реакций, к примеру, гидролитическое расщепление.

Работа биокатализатора начинается с момента присоединения его активного центра к субстрату. При этом говорят о комплементарном взаимодействии наподобие замка и ключа. Здесь имеется в виду полное совпадение формы активного центра с субстратом, что дает возможность ускорять реакцию.

Следующий этап заключается в протекании самой реакции. Ее скорость возрастает благодаря действию ферментативного комплекса. В конечном итоге мы получаем энзим, который связан с продуктами реакции.

Заключительный этап - отсоединение продуктов реакции от фермента, после чего активный центр вновь становится свободным для очередной работы.

Схематично работу фермента на каждом этапе можно записать так:

1) S + E ——> SE

2) SE ——> SP

3) SP ——> S + P , где S - это субстрат, E - фермент, а P - продукт.

Классификация ферментов

В организме человека можно найти огромное количество ферментов. Все знания об их функциях и работе были систематизированы, и в итоге появилась единая классификация, благодаря которой можно легко определить, для чего предназначен тот или иной катализатор. Здесь представлены 6 основных классов энзимов, а также примеры некоторых подгрупп.

1. Оксидоредуктазы.

Ферменты этого класса катализируют окислительно-восстановительные реакции. Всего выделяют 17 подгрупп. Оксидоредуктазы обычно имеют небелковую часть, представленную витамином или гемом.

Среди оксидоредуктаз часто встречаются следующие подгруппы:

а) Дегидрогеназы. Биохимия ферментов-дегидрогеназ заключается в отщеплении атомов водорода и переносе их на другой субстрат. Эта подгруппа чаще всего встречается в реакциях дыхания, фотосинтеза. В составе дегидрогеназ обязательно присутствует кофермент в виде НАД/НАДФ или флавопротеидов ФАД/ФМН. Нередко встречаются ионы металлов. Примерами могут служить такие энзимы, как цитохромредуктазы, пируватдегидрогеназа, изоцитратдегидрогеназа, а также многие ферменты печени (лактатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа и т. д.).

б) Оксидазы. Ряд ферментов катализирует присоединение кислорода к водороду, в результате чего продуктами реакции могут быть вода или пероксид водорода (H 2 0, H 2 0 2). Примеры ферментов: цитохромоксидаза, тирозиназа.

в) Пероксидазы и каталазы - энзимы, катализирующие распад H 2 O 2 на кислород и воду.

г) Оксигеназы. Эти биокатализаторы ускоряют присоединение кислорода к субстрату. Дофамингидроксилаза - один из примеров таких энзимов.

2. Трансферазы.

Задача ферментов этой группы состоит в переносе радикалов от вещества-донора к веществу-реципиенту.

а) Метилтрансферазы. ДНК-метилтрансферазы - основные ферменты, контролирующие процесс репликации нуклеотидов играет большую роль в регуляции работы нуклеиновой кислоты.

б) Ацилтрансферазы. Энзимы этой подгруппы транспортируют ацильную группу с одной молекулы на другую. Примеры ацилтрансфераз: лецитинхолестеринацилтрансфераза (переносит функциональную группу с жирной кислоты на холестерин), лизофосфатидилхолинацилтрансфераза (ацильная группа переносится на лизофосфатидилхолин).

в) Аминотрансферазы - ферменты, которые участвуют в превращении аминокислот. Примеры ферментов: аланинаминотрансфераза, которая катализирует синтез аланина из пирувата и глутамата путем переноса аминогруппы.

г) Фосфотрансферазы. Ферменты этой подгруппы катализируют присоединение фосфатной группы. Другое название фосфотрансфераз, киназы, встречается намного чаще. Примерами могут служить такие энзимы, как гексокиназы и аспартаткиназы, которые присоединяют фосфорные остатки к гексозам (чаще всего к глюкозе) и к аспарагиновой кислоте соответственно.

3. Гидролазы - класс энзимов, которые катализируют расщепление связей в молекуле с последующим присоединением воды. Вещества, которые относятся к этой группе, - основные ферменты пищеварения.

а) Эстеразы - разрывают эфирные связи. Пример - липазы, которые расщепляют жиры.

б) Гликозидазы. Биохимия ферментов этого ряда заключается в разрушении гликозидных связей полимеров (полисахаридов и олигосахаридов). Примеры: амилаза, сахараза, мальтаза.

в) Пептидазы - энзимы, катализирующие разрушение белков до аминокислот. К пептидазам относятся такие ферменты, как пепсины, трипсин, химотрипсин, карбоиксипептидаза.

г) Амидазы - расщепляют амидные связи. Примеры: аргиназа, уреаза, глутаминаза и т. д. Многие ферменты-амидазы встречаются в

4. Лиазы - ферменты, по функции схожие с гидролазами, однако при расщеплении связей в молекулах не затрачивается вода. Энзимы этого класса всегда имеют в составе небелковую часть, например, в виде витаминов В1 или В6.

а) Декарбоксилазы. Эти ферменты действуют на С-С связь. Примерами могут служить глутаматдекарбоксилаза или пируватдекарбоксилаза.

б) Гидратазы и дегидратазы - ферменты, которые катализируют реакцию расщепления связей С-О.

в) Амидин-лиазы - разрушают С-N связи. Пример: аргининсукцинатлиаза.

г) Р-О лиазы. Такие ферменты, как правило, отщепляют фосфатную группу от вещества-субстрата. Пример: аденилатциклаза.

Биохимия ферментов основана на их строении

Способности каждого энзима определяются индивидуальным, только ему свойственным строением. Любой фермент - это, прежде всего, белок, и его структура и степень сворачивания играют решающую роль в определении его функции.

Для каждого биокатализатора характерно наличие активного центра, который, в свою очередь, делится на несколько самостоятельных функциональных областей:

1) Каталитический центр - это специальная область белка, по которой происходит присоединение фермента к субстрату. В зависимости от конформации белковой молекулы каталитический центр может принимать разнообразную форму, которая должна соответствовать субстрату так же, как замок ключу. Такая сложная структура объясняет то, что находится в третичном или четвертичном состоянии.

2) Адсорбционный центр - выполняет роль «держателя». Здесь в первую очередь происходит связь между молекулой фермента и молекулой-субстратом. Однако связи, которые образует адсорбционный центр, очень слабые, а значит, каталитическая реакция на этом этапе обратима.

3) Аллостерические центры могут располагаться как в активном центре, так и по всей поверхности фермента в целом. Их функция - регулирование работы энзима. Регулирование происходит с помощью молекул-ингибиторов и молекул-активаторов.

Активаторные белки, связываясь с молекулой фермента, ускоряют его работу. Ингибиторы же, напротив, затормаживают каталитическую активность, причем это может происходить двумя способами: либо молекула связывается с аллостерическим центром в области активного центра фермента (конкурентное ингибирование), либо она присоединяется к другой области белка (неконкурентное ингибирование). считается более действенным. Ведь при этом закрывается место для связывания субстрата с ферментом, причем этот процесс возможен только в случае практически полного совпадения формы молекулы ингибитора и активного центра.

Энзим зачастую состоит не только из аминокислот, но и из других органических и неорганических веществ. Соответственно, выделяют апофермент - белковую часть, кофермент - органическую часть, и кофактор - неорганическую часть. Кофермент может быть представлен улгеводами, жирами, нуклеиновыми кислотами, витаминами. В свою очередь, кофактор - это чаще всего вспомогательные ионы металлов. Активность ферментов определяется его строением: дополнительные вещества, входящие в состав, меняют каталитические свойства. Разнообразные виды ферментов - это результат комбинирования всех перечисленных факторов образования комплекса.

Регуляция работы ферментов

Энзимы как биологически активные вещества не всегда необходимы организму. Биохимия ферментов такова, что они могут в случае чрезмерного катализа навредить живой клетке. Для предотвращения пагубного влияния энзимов на организм необходимо каким-то образом регулировать их работу.

Т. к. ферменты имеют белковую природу, они легко разрушаются при высоких температурах. Процесс денатурации обратим, однако он может существенно повлиять на работу веществ.

pH также играет большую роль в регуляции. Наибольшая активность ферментов, как правило, наблюдается при нейтральных значениях pH (7,0-7,2). Также есть энзимы, которые работают только в кислой среде или только в щелочной. Так, в клеточных лизосомах поддерживается низкий pH, при котором активность гидролитических ферментов максимальна. В случае их случайного попадания в цитоплазму, где среда уже ближе к нейтральной, их активность снизится. Такая защита от «самопоедания» основана на особенностях работы гидролаз.

Стоит упомянуть о значении кофермента и кофактора в составе ферментов. Наличие витаминов или ионов металла существенно влияет на функционирование некоторых специфических энзимов.

Номенклатура ферментов

Все ферменты организма принято называть в зависимости от их принадлежности к какому-либо из классов, а также по субстрату, с которым они вступают в реакцию. Иногда по используют в названии не один, а два субстрата.

Примеры названия некоторых энзимов:

1. Ферменты печени: лактат-дегидроген-аза, глутамат-дегидроген-аза.
2. Полное систематическое название фермента: лактат-НАД+-оксидоредукт-аза.

Сохранились и тривиальные названия, которые не придерживаются правил номенклатуры. Примерами являются пищеварительные ферменты: трипсин, химотрипсин, пепсин.

Процесс синтеза ферментов

Функции ферментов определяются еще на генетическом уровне. Т. к. молекула по большому счету - белок, то и ее синтез в точности повторяет процессы транскрипции и трансляции.

Синтез ферментов происходит по следующей схеме. Вначале с ДНК считывается информация о нужном энзиме, в результате чего образуется мРНК. Матричная РНК кодирует все аминокислоты, которые входят в состав энзима. Регуляция ферментов может происходить и на уровне ДНК: если продукта катализируемой реакции достаточно, транскрипция гена прекращается и наоборот, если возникла потребность в продукте, активизируется процесс транскрипции.

После того как мРНК вышла в цитоплазму клетки, начинается следующий этап - трансляция. На рибосомах эндоплазматической сети синтезируется первичная цепочка, состоящая из аминокислот, соединенных пептидными связями. Однако молекула белка в первичной структуре еще не может выполнять свои ферментативные функции.

Активность ферментов зависит от структуры белка. На той же ЭПС происходит скручивание протеина, в результате чего образуются сначала вторичная, а потом третичная структуры. Синтез некоторых ферментов останавливается уже на этом этапе, однако для активизации каталитической активности зачастую необходимо присоединение кофермента и кофактора.

В определенных областях эндоплазматической сети происходит присоединение органических составляющих энзима: моносахаридов, нуклеиновых кислот, жиров, витаминов. Некоторые ферменты не могут работать без наличия кофермента.

Кофактор играет решающую роль в образовании Некоторые функции ферментов доступны только при достижении белком доменной организации. Поэтому для них очень важно наличие четвертичной структуры, в которой соединяющим звеном между несколькими глобулами белка является ион металла.

Множественные формы ферментов

Встречаются ситуации, когда необходимо наличие нескольких энзимов, катализирующих одну и ту же реакцию, но отличающихся друг от друга по каким-либо параметрам. Например, фермент может работать при 20 градусах, однако при 0 градусов он уже не сможет выполнять свои функции. Что делать в подобной ситуации живому организму при низких температурах среды?

Эта проблема легко решается наличием сразу нескольких ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию, но работающих в разных условиях. Существуют два типа множественных форм энзимов:

1. Изоферменты. Такие белки кодируются разными генами, состоят из разных аминокислот, однако катализируют одну и ту же реакцию.
2. Истинные множественные формы. Эти белки транскрибируются с одного и того же гена, однако на рибосомах происходит модификация пептидов. На выходе получают несколько форм одного и того же фермента.

В результате первый тип множественных форм сформирован на генетическом уровне, когда второй - на посттрансляционном.

Значение ферментов

В медицине сводится к выпуску новых лекарственных средств, в составе которых вещества уже находятся в нужных количествах. Ученые еще не нашли способ стимулирования синтеза недостающих энзимов в организме, однако сегодня широко распространены препараты, которые могут на время восполнить их недостаток.

Различные ферменты в клетке катализируют большое количество реакций, связанных с поддержанием жизнедеятельности. Одними из таких энизмов являются представители группы нуклеаз: эндонуклеазы и экзонуклеазы. Их работа заключается в поддержании постоянного уровня нуклеиновых кислот в клетке, удалении поврежденных ДНК и РНК.

Не стоит забывать о таком явлении, как свертывание крови. Являясь эффективной мерой защиты, данный процесс находится под контролем ряда ферментов. Главным из них является тромбин, который переводит неактивный белок фибриноген в активный фибрин. Его нити создают своеобразную сеть, которая закупоривает место повреждения сосуда, тем самым препятствуя излишней кровопотере.

Ферменты используются в виноделии, пивоварении, получении многих кисломолочных продуктов. Для получения спирта из глюкозы могут использоваться дрожжи, однако для удачного протекания этого процесса достаточно и экстракта из них.

Интересные факты, о которых вы не знали

Все ферменты организма имеют огромную массу - от 5000 до 1000000 Да. Это связано с наличием белка в составе молекулы. Для сравнения: молекулярная масса глюкозы - 180 Да, а углекислого газа - всего 44 Да.

На сегодняшний день открыто более чем 2000 ферментов, которые были обнаружены в клетках различных организмов. Однако большинство из этих веществ до конца еще не изучено.

Активность ферментов используется для получения эффективных стиральных порошков. Здесь энзимы выполняют ту же роль, что и в организме: они разрушают органические вещества, и это свойство помогает в борьбе с пятнами. Рекомендуется использовать подобный стиральный порошок при температуре не выше 50 градусов, иначе может пойти процесс денатурации.

По статистике, 20% людей по всему миру страдает от недостатка какого-либо из ферментов.

О свойствах энзимов знали очень давно, однако только в 1897 году люди поняли, что для сбраживания сахара в спирт можно использовать не сами дрожжи, а экстракт из их клеток.

Лекция 15. Ферменты: строение, свойства, функции.

План лекции:

1. Общая характеристика ферментов.

2. Строение ферментов.

3. Механизм ферментативного катализа.

4. Свойства ферментов.

5. Номенклатура ферментов.

6. Классификация ферментов.

7. изоферменты

8. Кинетика ферментативных реакций.

9. Единицы измерения ферментативной активности

1. Общая характеристика ферментов.

В нормальных физиологических условиях биохимические реакции в организме протекают с высокими скоростями, что обеспечивается биологическими катализаторами белковой природы – ферментами.

Их изучением занимается наука энзимология – наука об энзимах (ферментах), специфических белках – катализаторах, синтезируемых любой живой клеткой и активирующих различные биохимические реакции, протекающие в организме. Некоторые клетки могут содержать до 1000 различных ферментов.

2. Строение ферментов.

Ферменты – это белки с высокой молекулярной массой. Как всякие белки, ферменты имеют первичный, вторичный, третичный и четвертичный уровни организации молекул. Первичная структура представляет собой последовательное соединение аминокислот и обусловлена наследственными особенностями организма, именно она в значительной степени характеризует индивидуальные свойства ферментов. Вторичная структура ферментов организованна в виде альфа – спирали. Третичная структура имеет вид глобулы и участвует в формировании активного и других центров. Многие ферменты имеют четвертичную структуру и представляют собой объединение нескольких субъединиц, каждая из которых характеризуется тремя уровнями организации молекул различающихся друг от друга, как в качественном, так и в количественном соотношении.

Если ферменты представлены простыми белками, т. е. состоят только из аминокислот, их называют простыми ферментами. К простым ферментам относят пепсин, амилазу, липазу (практически все ферменты ЖКТ).

Сложные ферменты состоят из белковой и небелковой частей. Белковая часть фермента называется - апоферментом, небелковая – коферментом. Кофермент с апоферментом образуют холофермент. Кофермент может соединятся с белковой частью или только на время реакции, или связываться друг с другом постоянной прочной связью (тогда небелковая часть называется – простетической группой ). В любом случае небелковые компоненты принимают непосредственное участие в химических реакциях путем взаимодействия с субстратом. Коферменты могут быть представлены:

Нуклеозидтрифосфатами.

Минеральными веществами (цинк, медь, магний).

Активными формами витаминов (В 1 входит в состав фермента – декарбоксилазу, В 2 – входит в дегидрогеназу, В 6 – входит в трансферазы).

Основные функции коферментов :

Участие в акте катализа.

Осуществление контакта между ферментом и субстратом.

Стабилизация апофермента.

Апофермент, в свою очередь усиливает каталитическую активность небелковой части и определяет специфичность действия ферментов.

В каждом ферменте выделяют несколько функциональных центров.

Активный центр – зона молекулы фермента, которая специфически взаимодействует с субстратом. Активный центр представлен функциональными группами нескольких остатков аминокислот, именно в нем происходит присоединение и химическое превращение субстрата.

Аллостерический центр или регуляторный – это зона фермента ответственная за присоединение активаторов и ингибиторов. Данный центр участвует в регуляции активности фермента.

Эти центры находятся на разных участках молекулы фермента.

0

История развития науки о ферментах

В основе всех жизненных процессов лежат тысячи химических реакций. Они идут в организме без применения высокой температуры и давления, т. е. в мягких условиях. Вещества, котopыe окисляются в клетках человека и животных, сгорают быстро и эффективно, обогащая организм энергией и строительным материалом. Но те же вещества могут годами храниться как в консервированном (изолированном от воздуха) виде, так и на воздухе в присутствии кислорода. Например, мясные и рыбные консервы, пастеризованное молоко, сахар, крупы не разлагаются при довольно длительном хранении. Возможность быстрого переваривания продуктов в живом организме осуществляется благодаря присутствию в клетках особых биологических катализаторов - ферментов.

Ферменты - это специфические белки, входящие в состав всех клеток и тканей живых организмов, играющие роль биологических катализаторов. О ферментах люди узнали давно. Еще в начале прошлого века в Петербурге К. С. Кирхгоф выяснил, что проросший ячмень способен превращать полисахарид крахмал в дисахарид мальтозу, а экстракт дрожжей расщеплял свекловичный сахар на моносахариды - глюкозу и фруктозу. Это были первые исследования в ферментологии. А практическое применение ферментативных процессов было известно с незапамятных времен. Это и сбраживание винограда, и закваска при приготовлении хлеба, и сыроварение, и многое другое.

Сейчас в разных учебниках, пособиях и в научной литературе применяются два понятия: «ферменты» и «энзимы». Эти названия идентичны. Они обозначают одно и то же - биологические катализаторы. Первое слово переводится как «закваска», второе - «в дрожжах».

Долгое время не представляли, что же происходит в дрожжах, какая сила, присутствующая в них, заставляет вещества разрушаться и превращаться в более простые. И только после изобретения микроскопа было установлено, что дрожжи - это скопление большого количества микроорганизмов, которые используют сахар в качестве своего основного питательного вещества. Иными словами, каждая дрожжевая клетка «начинена» ферментами, способными разлагать сахар. Но в то же время были известны и другие биологические катализаторы, не заключенные в живую клетку, а свободно «обитающие» вне ее. Например, они были найдены в составе желудочных соков, клеточных экстрактов. В связи с этим в прошлом различали два типа катализаторов: считалось, что собственно ферменты неотделимы от клетки и вне ее не могут функционировать, т. е. они «организованы». А «неорганизованные» катализаторы, которые могут работать вне клетки, называли энзимами. Такое противопоставление «живых» ферментов и «неживых» энзимов объяснялось влиянием виталистов, борьбой материализма и идеализма в естествознании. Точки зрения ученых разделились. Основоположник микробиологии Л. Пастер утверждал, что деятельность ферментов определяется жизнью клетки. Если клетку разрушить, то прекратится и действие фермента. Химики во главе с Ю. Либихом развивали чисто химическую теорию брожения, доказывая, что активность ферментов не зависит от существования клетки.

В 1871 г. русский врач М. М. Манассеина разрушила дрожжевые клетки, растирая их с речным песком. Клеточный сок, отделенный от остатков клеток, сохранял свою способность сбраживать сахар. Этот простой и убедительный опыт русского врача остался без должного внимания в царской России. Через четверть века немецкий ученый Э. Бухнер получил бесклеточный сок прессованием живых дрожжей под давлением до 5·10 6 Па. Этот сок, подобно живым дрожжам, сбраживал сахар с образованием спирта и оксида углерода (IV):

Работы А. Н. Лебедева по исследованию дрожжевых клеток и труды других ученых положили конец виталистическим представлениям в теории биологического катализа, а термины «фермент» и «энзим» стали применять как равнозначные.

В наши дни ферментология - это самостоятельная наука. Выделено и изучено около 2000 ферментов. Вклад в эту науку внесли советские ученые - наши современники А. Е. Браунштейн, В. Н. Орехович, В. А. Энгельгард, А. А. Покровский и др.

Химическая природа ферментов

В конце прошлого века было высказано предположение, что ферменты - это белки или какие-то вещества, очень похожие на белки. Потеря активности фермента при нагревании очень напоминает тепловую денатурацию белка. Диапазон температур при денатурации и при инактивации одинаков. Как известно, денатурация белка может быть вызвана не только нагреванием, но и действием кислот, солей тяжелых металлов, щелочей, длительным облучением ультрафиолетовыми лучами. Эти же химические и физические факторы приводят к потере активности фермента.

В растворах ферменты, как и белки, ведут себя под действием электрического тока сходным образом: молекулы движутся к катоду или аноду. Изменение концентрации водородных ионов в растворах белков или ферментов приводит к накоплению ими положительного или отрицательного заряда. Это доказывает амфотерный характер ферментов и тоже подтверждает их белковую природу. Еще одно свидетельство белковой природы ферментов - они не проходят через полупропицаемые мембраны. Это также доказывает их большую молекулярную массу. Но если ферменты - это белки, то при дегидратации их активность не должна уменьшаться. Опыты подтверждают правильность такого предположения.

Интересный опыт был проведен в лаборатории И. П. Павлова. Получая желудочный сок через фистулу у собак, сотрудники обнаружили, что, чем больше белка в соке, тем больше его активность, т. е. определяемый белок и есть фермент желудочного сока.

Таким образом, явления денатурации и подвижности в электрическом поле, амфотерность молекул, высокомолекулярная природа, способность осаждаться из раствора при действии водоотнимающих средств (ацетон или спирт) доказывают белковую природу ферментов.

К настоящему времени этот факт установлен многими, еще более тонкими физическими, химическими или биологическими методами.

Мы уже знаем, что белки бывают очень разные по составу и прежде всего они могут быть простыми или сложными. К каким же белкам относятся известные ныне ферменты?

Ученые различных стран установили, что многие ферменты - это простые белки. Это значит, что при гидролизе молекулы этих ферментов распадаются только до аминокислот. Ничего, кроме аминокислот, в гидролизате таких белков-ферментов обнаружить не удается. К простым ферментам относятся пепсин - фермент, переваривающий белки в желудке и содержащийся в желудочном соке, трипсин - фермент поджелудочного сока, папаин - растительный фермент, уреаза и др.

В сложные ферменты входят, кроме аминокислот, вещества, имеющие небелковую природу. Например, окислительно-восстановительные ферменты, встроенные в митохондрию, содержат, кроме белковой части, атомы железа, меди и другие термостабильные группы. Небелковой частью фермента могут быть и более сложные вещества: витамины, нуклеотиды (мономеры нуклеиновых кислот), нуклеотиды с тремя фосфорными остатками и т. д. Условились называть в таких сложных белках небелковую часть - кофермент, а белковую- апофермент.

Отличие ферментов от небиологических катализаторов

В школьных учебниках и пособиях по химии подробно разбирается действие катализаторов, дается представление об энергетическом барьере, энергии активации. Напомним только, что роль катализаторов заключается в их способности активировать молекулы веществ, вступающих в реакцию. Это приводит к снижению энергии активации. Реакция идет не в один, а в несколько этапов с образованием промежуточных соединений. Катализаторы не изменяют направление реакции, а только влияют на скорость достижения состояния химического равновесия. В катализируемой реакции всегда затрачивается меньше энергии по сравнению с некатализируемой. В ходе реакции фермент меняет свою упаковку, «напрягается» и по окончании реакции принимает исходную структуру, возвращается к первоначальной форме.

Ферменты те же катализаторы. Им свойственны все законы катализа. Но ферменты - белки, и это сообщает им особые свойства. Что же общего у ферментов с привычными для нас катализаторами, например платиной, оксидом ванадия (V) и другими неорганическими ускорителями реакций, а что их отличает?

Один и тот же неорганический катализатор может применяться в разных производствах. А фермент катализирует только одну реакцию или один вид реакции, т. е. он более специфичен, чем неорганический катализатор.

Температура всегда влияет на скорости химических реакций. Большинство реакций с неорганическими катализаторами идет при очень высоких температурах. При повышении температуры скорость реакции, как правило, увеличивается (рис. 1). Для ферментативных реакций это увеличение ограничено определенной температурой (температурный оптимум). Дальнейшее повышение температуры вызывает изменения в молекуле фермента, приводящие к уменьшению скорости реакции (рис. 1). Но некоторые ферменты, например ферменты микроорганизмов, обнаруженных в воде горячих природных источников, не только выдерживают температуры, близкие к точке кипения воды, но и даже, проявляют свою максимальную активность. Для большинства же ферментов температурный оптимум близок к 35-45 °С. При более высоких температурах их активность уменьшается, а затем происходит полная тепловая денатурация.

Рис. 1. Влияние температуры на активность ферментов: 1 - увеличение скорости реакции, 2 - уменьшение скорости реакции.

Многие неорганические катализаторы проявляют свою максимальную эффективность в сильнокислой или сильно-щелочной среде. В отличие от них ферменты активны только при физиологических значениях кислотности раствора, только при такой концентрации ионов водорода, которая совместима с жизнью и нормальным функционированием клетки, органа или системы.

Реакции с участием неорганических катализаторов протекают, как правило, при высоких давлениях, а ферменты работают при нормальном (атмосферном) давлении.

И самым удивительным отличием фермента от других катализаторов является то, что скорость реакций, катализируемых ферментами, в десятки тысяч, а иногда и в миллионы раз выше той, которая может быть достигнута при участии неорганических катализаторов.

Известный всем пероксид водорода, применяемый в быту как отбеливающее и дезинфицирующее вещество, без катализаторов разлагается медленно:

В присутствии неорганического катализатора (солей железа) эта реакция идет несколько быстрее. А каталаза (фермент, присутствующий практически во всех клетках) разрушает пероксид водорода с невообразимой скоростью: одна молекула каталазы расщепляет в одну минуту более 5 млн. молекул Н 2 О 2 .

Универсальное распространение каталазы в клетках всех органов аэробных организмов и высокая активность этого фермента объясняются тем, что пероксид водорода - это мощный клеточный яд. Он получается в клетках как побочный продукт многих реакций, но на страже стоит фермент каталаза, который сейчас же разрушает пероксид водорода на безвредные кислород и воду.

Активный центр фермента

Обязательным этапом в катализируемой реакции является взаимодействие фермента с тем веществом, превращение которого он катализирует,- с субстратом: образуется фермент-субстратный комплекс. В приведенном выше примере пероксид водорода - это субстрат для действия каталазы.

Интересным оказывается то, что в ферментативных реакциях молекула субстрата во много раз меньше, чем молекула белка-фермента. Следовательно, субстрат не может контактировать со всей огромной молекулой фермента, а только с каким-то ее небольшим участком или даже отдельной группой, атомом. Для подтверждения этого предположения ученые отщепляли от фермента одну или несколько аминокислот, и это не влияло или почти не влияло на скорость катализируемой реакции. Но отщепление отдельных определенных аминокислот или группы приводило к полной потере каталитических свойств фермента. Так сформировалось представление об активном центре фермента.

Активный центр - это такой участок белковой молекулы, который обеспечивает соединение фермента с субстратом и дает возможность для дальнейших превращений субстрата. Были изучены некоторые активные центры разных ферментов. Это или функциональная группа (например, ОН-группа серина), или отдельная аминокислота. Иногда для обеспечения каталитического действия нужно несколько аминокислот в определенном порядке.

В составе активного центра выделяют различные по своим функциям участки. Одни участки активного центра обеспечивают сцепление с субстратом, прочный контакт с ним. Поэтому их называют якорными или контактными участками. Другие выполняют собственно каталитическую функцию, активируют субстрат - каталитические участки. Такое условное разделение активного центра помогает более точно представить механизм каталитической реакции.

Тип химической связи в фермент-субстратных комплексах тоже изучался. Вещество (субстрат) удерживается на ферменте при участии самых различных типов связей: водородных мостиков, ионных, ковалентных, донорно-акцепторных связей, ван-дер-ваальсовых сил сцепления.

Деформация молекул фермента в растворе приводит к появлению его изомеров, отличающихся третичной структурой. Иными словами, фермент ориентирует свои функциональные группы, входящие в активный центр, так, чтобы проявилась наибольшая каталитическая активность. Но и молекулы субстрата также могут деформироваться, «напрягаться» при взаимодействии с ферментом. Эти современные представления о фермент-субстратном взаимодействии отличаются от господствовавшей ранее теории Э. Фишера, который считал, что молекула субстрата точно соответствует активному центру фермента и подходит к нему как ключ к замку.

Свойства ферментов

Важнейшим свойством ферментов является преимущественное ускорение одной из нескольких теоретически возможных реакций. Это позволяет субстратам выбрать наиболее выгодные для организма цепочки превращений из целого ряда возможных путей.

В зависимости от условий ферменты способны катализировать как прямую, так и обратную реакции. Например, пировиноградная кислота под влиянием фермента лактатдегидрогеназы превращается в конечный продукт брожения - молочную кислоту. Этот же фермент катализирует и обратную реакцию, и само название он получил не по прямой, а по обратной реакции. Обе реакции происходят в организме при разных условиях:

Это свойство ферментов имеет большое практическое значение.

Другое важное свойство ферментов - термолабильность, т. е. высокая чувствительность к изменениям температуры. Мы уже говорили, что ферменты являются белками. Для большинства из них температура свыше 70 °С приводит к денатурации и потере активности. Из курса химии известно, что повышение температуры на 10 °С приводит к увеличению скорости реакции в 2-3 раза, что характерно и для ферментативных реакций, но до определенного предела. При температурах, близких к 0 °С, скорость ферментативных реакций замедляется до минимума. Это свойство широко используется в различных отраслях народного хозяйства, особенно в сельском хозяйстве и медицине. Например, все существующие сейчас способы консервации почки перед ее пересадкой больному включают охлаждение этого органа, чтобы снизить интенсивность биохимических реакций и продлить время жизни почки до ее пересадки человеку. Такой прием сохранил здоровье и спас жизнь десяткам тысяч людей в мире.

Рис. 2. Влияние pH на активность ферментов.

Одним из важнейших свойств белков-ферментов является их чувствительность к реакции среды, концентрации водородных ионов или гидроксид-ионов. Ферменты активны только в узком интервале кислотности или щелочности среды (pH). Например, активность пепсина в полости желудка максимальна при pH около 1 -1,5. Снижение кислотности приводит к глубокому нарушению пищеварительного акта, недоперевариванию пищи и тяжелым осложнениям. Из курса биологии вам известно, что пищеварение начинается уже в ротовой полости, где присутствует амилаза слюны. Оптимальное значение pH для нее 6,8-7,4. Для разных ферментов пищеварительного тракта характерны большие различия в оптимуме pH (рис. 2). Изменение реакции среды приводит к изменению зарядов на молекуле фермента или даже в его активном центре, вызывая снижение или полную потерю активности.

Следующим важным свойством является специфичность действия фермента. Каталаза расщепляет только пероксид водорода, уреаза - только мочевину H 2 N-СО-NH 2 , т. е. фермент катализирует превращение только одного субстрата, только его молекулу он «узнает». Такая специфичность считается абсолютной. Если фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих одинаковую функциональную группу, то такая специфичность называется групповой. Например, фосфатаза катализирует отщепление остатка фосфорной кислоты:

Разновидностью специфичности является чувствительность фермента только к одному изомеру - стерео-химическая специфичность.

Ферменты влияют на скорость превращения различных веществ. Но и на ферменты влияют некоторые вещества, резко изменяя их активность. Вещества, которые повышают активность ферментов, активизируют их, называются активаторами, а угнетающие их - ингибиторами. Ингибиторы могут подействовать на фермент необратимо. После их действия фермент уже никогда не может катализировать свою реакцию, так как его структура будет сильно изменена. Так действуют на фермент соли тяжелых металлов, кислоты, щелочи. Обратимый ингибитор может быть удален из раствора, и фермент вновь приобретает активность. Такое обратимое ингибирование часто протекает по конкурентному типу, т. е. за активный центр борются субстрат и похожий на него ингибитор. Снять такое ингибирование можно, если увеличить концентрацию субстрата и вытеснить ингибитор с активного центра субстратом.

Важным свойством многих ферментов является то, что они находятся в тканях и клетках в неактивной форме (рис. 3). Неактивная форма ферментов называется проферментом. Классическими его примерами являются неактивные формы пепсина или трипсина. Существование неактивных форм ферментов имеет большое биологическое значение. Если бы пепсин или трипсин вырабатывались сразу в активной форме, то это приводило бы к тому, что, например, пепсин «переваривал» стенку желудка, т. е. желудок «переваривал» сам себя. Такого не происходит потому, что пепсин или трипсин становятся активными только после попадания в полость желудка или в тонкий кишечник: от пепсина под действием соляной кислоты, содержащейся в желудочном соке, отщепляется несколько аминокислот, и он приобретает способность расщеплять белки. А сам желудок предохранен теперь от действия пищеварительных ферментов слизистой оболочкой, выстилающей его полость.

Рис. 3 Схема превращения трипсиногена в активный трипсин: А - трипсиноген; Б - трипсин; 1 - место отрыва пептида; 2 - водородные связи; 3 - дисульфидный мостик; 4 - пептид, отщепленный при активации.

Процесс активации фермента идет, как правило, одним из четырех путей, представленных на рисунке 4. В первом случае отщепление пептида от неактивного фермента «открывает» активный центр и делает фермент активным.

Рис. 4 Пути активации ферментов (штриховкой отмечена молекула субстрата):

1 - отщепление от профермента небольшого участка (пептида) и превращение неактивного профермента в активный фермент; 2 - образование дисульфидных связей из SH-групп, освобождающее активный центр; 3 - образование комплекса белка с металлами, активирующее фермент: 4 образование комплекса фермента с каким-нибудь веществом (при этом освобождается доступ к активному центру).

Второй путь представляет собой образование дисульфидных S-S-мостиков, делающих доступным активный центр. В третьем случае присутствие металла активирует фермент, который может работать только в комплексе с этим металлом. Четвертый путь иллюстрирует активацию каким-то веществом, которое связывается с периферическим участком белковой молекулы и деформирует фермент таким образом, чтобы облегчить доступ субстрата к активному центру.

В последние годы обнаружен еще один способ регуляции активности ферментов Выяснилось, что один фермент, например лактатде-гидрогеназа, может находиться в нескольких молекулярных формах, отличающихся между собой, хотя они все катализируют одну реакцию. Такие различные по составу молекулы фермента, которые катализируют одну и ту же реакцию, встречаются даже внутри одной и той же клетки. Их называют изоферментами, т. е. изомерами фермента. У названной уже лактатдегидрогеназы найдено пять различных изоферментов. Какова роль нескольких форм одного фермента? Видимо, организм «подстраховывает» некоторые особенно важные реакции, когда при изменении условий в клетке работает то одна, то другая форма изофермента, и обеспечивает необходимую скорость и направление течения процесса.

И еще одно важное свойство ферментов. Часто они функционируют в клетке не отдельно друг от друга, а организованы в виде комплексов - ферментных систем (рис. 5): продукт предыдущей реакции - субстрат для последующей. Эти системы встроены в клеточные мембраны и обеспечивают быстрое направленное окисление вещества, «перебрасывая» его от фермента к ферменту. Синтетические процессы в клетке идут в подобных же ферментных системах.

Классификация ферментов

Круг вопросов, изучаемых ферментологией, широк. Количество ферментов, применяемых в здравоохранении, сельском хозяйстве, микробиологии и других отраслях науки и практики, велико. Это создавало трудность при характеристике ферментативных реакций, так как один и тот же фермент можно назвать или по субстрату, или по типу катализируемых реакций, или старым термином,прочно вошедшим в литературу: например пепсин, трипсин, каталаза.

Рис. 5. Предполагаемая структура мультиферментного комплекса, синтезирующего жирные кислоты (семь ферментных субъединиц отвечают за семь химических реакций).

Поэтому в 1961 г. Международный биохимический съезд в Москве утвердил классификацию ферментов, в основу которой положен тип реакции, катализируемой данным ферментом. В названии фермента обязательно присутствует название субстрата, т. е. того соединения, на которое воздействует данный фермент, и окончание -аза. Например, аргиназа катализирует гидролиз аргинина.

По этому принципу все ферменты были разделены на шесть классов.

1. Оксидоредуктазы-ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции, например каталаза:

2. Трансферазы - ферменты, катализирующие перенос атомов или радикалов, например метилтрансферазы, переносящие СНз-группу:

3. Гидролазы - ферменты, разрывающие внутримолекулярные связи путем присоединения молекул воды, например фосфатаза:

4. Лиазы - ферменты, отщепляющие от субстрата ту или иную группу без присоединения воды, негидролитическим путем, например отщепление карбоксильной группы декарбоксилазой:

5. Изомеразы - ферменты, катализирующие превращение одного изомера в другой:

Глюкозо-6-фосфат-›глюкозо-1-фосфат

6. Ферменты, катализирующие реакции синтеза, например синтез пептидов из аминокислот. Этот класс ферментов носит название синтетаз.

Каждый фермент предложили закодировать шифром из четырех цифр, где первая из них обозначает номер класса, а остальные три характеризуют более подробно свойства фермента, его подкласс и индивидуальный номер в каталоге.

В качестве примера классификации ферментов приведем четырехзначный код, присвоенный пепсину,- 3.4.4Л. Цифра 3 обозначает класс фермента - гидролазы. Следующая цифра 4 кодирует подкласс пептидгидролаз, т. е. тех ферментов, которые гидролизуют именно пептидные связи. Еще одна цифра 4 обозначает под-подкласс, называемый пептидилпептидгидролазами. В этот подподкласс входят уже индивидуальные ферменты, и первым в нем значится пепсин, которому и присвоен порядковый номер 1.

Так получается его код - 3.4.4.1. Точки приложения действия ферментов класса гидролаз показаны на рисунке 6.

Рис. 6. Расщепление пептидных связей различными протеолитнческими ферментами.

Действие ферментов

Обычно ферменты выделяют из различных объектов животного, растительного или микробного происхождения и изучают их действие вне клетки и организма. Эти исследования очень важны для понимания механизма действия ферментов, изучения их состава, особенностей катализируемых ими реакций. Но полученные таким образом сведения нельзя механически непосредственно переносить на деятельность ферментов в живой клетке. Вне клетки трудно воспроизвести те условия, в которых работает фермент, например в митохондрии или лизосоме. К тому же не всегда известно, сколько из имеющихся молекул фермента участвует в реакции - все или только какая-то их часть.

Почти всегда оказывается, что клетка содержит тот или иной фермент, по содержанию превышающий в несколько десятков раз необходимое количество для осуществления нормального обмена веществ. Обмен веществ различен по интенсивности в разные периоды жизни клетки, однако ферментов в ней значительно больше, чем того требовал бы самый максимальный уровень обмена веществ. Например, в состав клеток сердечной мышцы входит столько цитохрома с, которое могло бы осуществить окисление, в 20 раз большее, чем максимальное потребление кислорода сердечной мышцей. Позднее были обнаружены вещества, которые могут «выключать» часть молекул ферментов. Это так называемые тормозящие факторы. Для понимания механизма действия ферментов важно и то, что в клетке они находятся не просто в растворе, а встроены в структуру клетки. Сейчас уже известно, какие ферменты вмонтированы в наружную мембрану митохондрии, какие встроены во внутреннюю, какие связаны с ядром, лизосомами и другими субклеточными структурами.

Близкое «территориальное» расположение фермента, катализирующего первую реакцию, к ферментам, катализирующим вторую, третью и последующие реакции, сильно влияет на суммарный результат их действия. Например, в митохондрии вмонтирована цепь ферментов, передающих электроны на кислород,- цитохромная система. Она катализирует окисление субстратов с образованием энергии, которая аккумулируется в АТФ.

При извлечении ферментов из клетки слаженность их совместной работы нарушается. Поэтому изучать работу ферментов стараются без разрушения тех структур, в которые встроены их молекулы. Например, если срез ткани подержать в растворе субстрата, а затем обработать реактивом, который с продуктами реакции даст окрашенный комплекс, то в микроскопе будут четко видны окрашенные участки клетки: в этих участках был локализован (расположен) фермент, который расщеплял субстрат. Так было установлено, в каких именно клетках желудка содержится пепсиноген, из которого получается фермент пепсин.

Сейчас широко распространен другой метод, который позволяет установить локализацию ферментов,- разделительное центрифугирование. Для этого исследуемую ткань (например, кусочки печени лабораторных животных) измельчают, а затем готовят из нее кашицу в растворе сахарозы. Смесь переносят в пробирки и вращают их с большими скоростями в центрифугах. Различные клеточные элементы в зависимости от их массы и размеров распределяются в плотном растворе сахарозы при вращении примерно следующим образом:

Для получения тяжелых ядер требуется относительно небольшое ускорение (меньшее число оборотов). После отделения ядер, увеличив число оборотов, последовательно осаждают митохондрии, микросомы, получают цитоплазму. Теперь активность ферментов можно изучать в каждой из выделенных фракций. Оказывается, что большинство из известных ферментов локализованы преимущественно в той или иной фракции. Например, фермент альдолаза локализован в цитоплазме, а фермент, окисляющий капроновую кислоту,- преимущественно в митохондриях.

При повреждении мембраны, в которую встроены ферменты, комплексные взаимосвязанные процессы не протекают, т. е. каждый фермент может действовать только сам по себе.

Клетки растений и микроорганизмов, как и клетки животных, содержат очень похожие клеточные фракции. Например, пластиды растений по ферментному набору напоминают митохондрии. В микроорганизмах обнаружены зерна, напоминающие рибосомы и тоже содержащие большие количества рибонуклеиновой кислоты. Ферменты, входящие в состав животных, растительных и микробных клеток, обладают сходным действием. Например, гиалуронидаза облегчает микробам проникновение в организм, способствуя разрушению клеточной стенки. Этот же фермент обнаружен в различных тканях животных организмов.

Получение и применение ферментов

Ферменты находятся во всех тканях животных и растений. Однако количество одного и того же фермента в разных тканях и прочность связи фермента с тканью неодинаковы. Поэтому практически его получение не всегда оправдано.

Источником получения ферментов могут быть пищеварительные соки человека и животных. В соках относительно мало посторонних примесей, клеточных элементов и других компонентов, от которых надо избавляться при получении чистого препарата. Это почти чистые растворы ферментов.

Из тканей получить фермент труднее. Для этого ткань измельчают, клеточные структуры разрушают, растирая измельченную ткань с песком, или обрабатывают ультразвуком. При этом ферменты «вываливаются» из клеток и мембранных структур. Их теперь очищают и отделяют друг от друга. Для очистки используют различную способность ферментов разделяться на хроматографических колонках, неодинаковую их подвижность в электрическом поле, осаждение их спиртом, солями, ацетоном и другие методы. Так как большинство ферментов связано с ядром, митохондриями, рибосомами или другими субклеточными структурами, сначала выделяют центрифугированием эту фракцию, а затем из нее извлекают фермент

Разработка новых методов очистки позволила получить ряд кристаллических ферментов в очень чистом виде, которые могут храниться годами.

Сейчас уже невозможно установить, когда люди впервые применили фермент, но можно с большой уверенностью утверждать, что это был фермент растительного происхождения. Люди давно обратили внимание на полезность того или иного растения не только как пищевого продукта. Например, аборигены Антильских островов издавна использовали сок дынного дерева для лечения язв и других кожных заболеваний.

Рассмотрим более подробно особенности получения и отрасли применения ферментов на примере одного из хорошо известных ныне растительных биокатализаторов - папаина. Этот фермент содержится в млечном соке во всех частях тропического плодового дерева папайи - гигантской древовидной травы, достигающей 10 м. Ее плоды похожи по форме и вкусу на дыню и содержат большое количество фермента папаина. Еще в начале XVI в. испанские мореплаватели обнаружили это растение в естественных условиях в Центральной Америке. Затем его завезли в Индию, а оттуда во все тропические страны. Васко да Гама, увидевший папайю в Индии, назвал ее золотым деревом жизни, а Марко Поло сказал, что папайя - это «дыня, вскарабкавшаяся на дерево». Мореплаватели знали, что плоды дерева спасают от цинги и дизентерии.

В нашей стране папайя растет на Черноморском побережье Кавказа, в ботаническом саду Академии наук России в специальных теплицах. Сырье для фермента - млечный сок - получают из надрезов на кожице плода. Затем сок сушат в лаборатории в вакуумных сушильных шкафах при невысоких температурах (не более 80 °С). Высушенный продукт растирают и хранят в стерильной упаковке, залитой парафином. Это уже достаточно активный препарат. Ферментативную активность его можно оценить по количеству расщепленного за единицу времени белка казеина. За одну биологическую единицу активности папаина принимают такое количество фермента, которого при введении в кровь достаточно для появления симптома «свисания ушей» у кролика массой 1 кг. Этот феномен происходит потому, что папаин начинает действовать на коллагеновые белковые нити в ушах кролика.

Папаин обладает целым спектром свойсте: протеолитическим, противовоспалительным, антикоагуляционным (препятствующим свертыванию крови), дегидратационным, болеутоляющим и бактерицидным. Он разрушает белки до полипептидов и аминокислот. Причем это расщепление идет глубже, чем при действии других ферментов животного и бактериального происхождения. Особенностью папаина является его способность быть активным в широком интервале pH и при больших колебаниях температуры, что особенно важно и удобно для широкого применения этого фермента. А если к тому же учесть, что для получения ферментов, сходных по действию с папаином (пепсин, трипсин, лидаза), требуются кровь, печень, мышцы или другие ткани животных, то преимущество и экономическая эффективность растительного фермента папаина несомненны.

Области применения папаина очень разнообразны. В медицине он используется для обработки ран, где способствует расщеплению белков поврежденных тканей и очищает раневую поверхность. Незаменим папаин при лечении различных заболеваний глаз. Он вызывает рассасывание помутневших структур органа зрения, делая их прозрачными. Известно положительное действие фермента при заболеваниях органов пищеварения. Хорошие результаты получены при применении папаина для лечения кожных болезней, ожогов, а также в невропатологии, урологии и других отраслях медицины.

Кроме медицины, большое количество этого фермента расходуется в виноделии и пивоварении. Папаин увеличивает сроки хранения напитков. При обработке папаином мясо становится мягким и быстроусваиваемым, сроки хранения продуктов резко увеличиваются. Шерсть, идущая в текстильную промышленность, после обработки папаином не скручивается и не сопровождается усадкой. Недавно папаин начали применять в кожевенном производстве. Кожаные изделия после обработки ферментом становятся мягкими, эластичными, более прочными и долговечными.

Тщательное изучение некоторых неизлечимых ранее болезней привело к необходимости вводить в организм недостающие ферменты для замены тех, активность которых снижена. Можно было бы ввести в организм необходимое количество недостающих ферментов или «добавить» молекулы тех ферментов, которые в органе или ткани снизили свою каталитическую активность. Но на эти ферменты организм реагирует как на чужеродные белки, отторгает их, вырабатывает на них антитела, что в конце концов приводит к быстрому распаду введенных белков. Ожидаемого терапевтического эффекта не будет. Вводить ферменты с пищей тоже нельзя, так как пищеварительные соки их «переварят» и они потеряют свою активность, распадутся до аминокислот, не дойдя до клеток и тканей. Введение ферментов прямо в кровоток приводит их к разрушению тканевыми протеазами. Устранить эти трудности удается, применяя иммобилизованные ферменты. В основе принципа иммобилизации лежит способность ферментов «привязываться» к стабильному носителю органической или неорганической природы. Примером химического связывания фермента с матрицей (носителем) является образование прочных ковалентных связей между их функциональными группами. Матрицей может быть, например, пористое стекло, содержащее функциональные аминогруппы, к которым химически «привязывают» фермент.

При применении ферментов часто возникает необходимость сравнивать их активности. Как узнать более активный фермент? Как рассчитать активность разных очищенных препаратов? Условились за активность фермента принимать количество субстрата, которое за одну минуту может превратить 1 г ткани, содержащий этот фермент, при 25 °С. Чем больше субстрата переработал фермент, тем он активнее. Активность одного и того же фермента меняется в связи с возрастом, полом, временем суток, состоянием организма, а также зависит от желез внутренней секреции, вырабатывающих гормоны.

Природа почти не ошибается, производя одинаковые белки в течение всей жизни организма и передавая эту строгую информацию о производстве тех же белков из поколения в поколение. Однако иногда в организме появляется измененный белок, в составе которого встречается одна или несколько «лишних» аминокислот или, наоборот, они утрачены. В настоящее время известно много таких молекулярных ошибок. Они объясняются разными причинами и могут вызвать болезненные изменения в организме. Такие болезни, в появлении которых повинны ненормальные молекулы белка, получили в медицине название молекулярных. Например, гемоглобин здорового человека, состоящий из двух полипептидных цепей (а и в), и гемоглобин больного серповидно-клеточной анемией (эритроцит имеет форму серпа) отличаются только тем, что у больных в в-цепи глутаминовая кислота заменена валином. Серповидно-клеточная анемия - это наследственная болезнь. Изменения гемоглобина передаются от родителей потомству.

Болезни, возникающие при изменении активности ферментов, называются ферментопатиями. Они, как правило, наследуются, передаются от родителей детям. Например, при врожденной фенилкетонурии нарушается следующее превращение:

При недостатке фермента фенилаланингидроксилазы фенилаланин не превращается в тирозин, а накапливается, что вызывает расстройство нормальной функции ряда органов, в первую очередь расстройство функции центральной нервной системы. Болезнь развивается с первых дней жизни ребенка, и к шести-семи месяцам жизни появляются ее первые симптомы. В крови и моче таких больных можно обнаружить огромные по сравнению с нормой количества фенилаланина. Своевременное выявление такой патологии и уменьшение приема той пищи, которая содержит много фенилаланина, оказывает положительное лечебное действие.

Другой пример: отсутствие у детей фермента, превращающего галактозу в глюкозу, приводит к накоплению в организме галактозы, которая в больших количествах накапливается в тканях и поражает печень, почки, глаза. Если отсутствие фермента обнаружено своевременно, то ребенка переводят на диету, не содержащую галактозу. Это ведет к исчезновению признаков заболевания.

Благодаря существованию ферментных препаратов расшифровывают структуру белков и нуклеиновых кислот. Без них невозможны производство антибиотиков, виноделие, хлебопечение, синтез витаминов. В сельском хозяйстве применяются стимуляторы роста, которые оказывают действие на активирование ферментативных процессов. Таким же свойством обладают многие лекарственные препараты, которые подавляют или активируют в организме деятельность ферментов.

Без ферментов невозможно представить себе развитие таких перспективных направлений, как воспроизводство химических процессов, происходящих в клетке, и создания на этой основе современной промышленной биотехнологии. Пока еще ни один современный химический завод не способен соперничать с обычным листком растения, в клетках которого с участием ферментов и солнечных лучей из воды и углекислого газа синтезируется огромное число разнообразных сложных органических веществ. При этом в атмосферу выделяется в большом количестве столь необходимый нам для жизни кислород.

Ферментология - молодая и перспективная наука, отделившаяся от биологии и химии и обещающая много удивительных открытий всем, кто решит заняться ею всерьез.

Скачать реферат: У вас нет доступа к скачиванию файлов с нашего сервера.

- (от лат. fermentum - закваска) (энзимы) - биологические катализаторы, присутствующие во всех живых клетках. Осуществляют превращения веществ в организме, направляя и регулируя тем самым его обмен веществ. По химической природе - белки. Ферменты обладают оптимальной активностью при определенном рН, наличии необходимых коферментов и кофакторов, отсутствии ингибиторов. Каждый вид ферментов катализирует превращение определенных веществ (субстратов), иногда лишь единственного вещества в единственном направлении. Поэтому многочисленные биохимические реакции в клетках осуществляет огромное число различных ферментов. Все ферменты подразделяются на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы,гидролазы, лиазы, изомеразы и лигазы. Многие ферменты выделены из живых клеток и получены в кристаллическом виде (впервые в 1926). Ферментные препараты применяют в медицине, в пищевой и легкой промышленности.

Ферменты - специфические белки, присутствующие во всех живых клетках и играющие роль биологических катализаторов. Через их посредство реализуется генетическая информация и осуществляются все процессы обмена веществ и энергии в живых организмах. Ферменты бывают простыми или сложными белками, в состав которых наряду с белковым компонентом (апоферментом) входит небелковая часть - кофермент. Эффективность действия ферментов определяется значительным снижением энергии активации катализируемой реакции в результате образования промежуточных фермент-субстратных комплексов. Присоединение субстратов происходит в активных центрах, которые обладают сходством только с определенными субстратами, чем достигается высокая специфичность (избирательность) действия ферментов. Одна из особенностей ферментов - способность к направленному и регулируемому действию. За счёт этого контролируется согласованность всех звеньев обмена веществ. Эта способность определяется пространственность структурной молекулы ферментов. Она реализуется через изменение скорости действия ферментов и зависит от концентрации соответствующих субстратов и кофакторов, рH среды, температуры, а также от присутствия специфических активаторов и ингибиторов (например, адениловых нуклеотидов, карбонильных, сульфгидрильных соединений и др.). Некоторые ферменты помимо активных центров имеют дополнительные, т.н. аллостерические регуляторные центры. Биосинтез ферментов находится под контролем генов. Различают конститутивные ферменты, постоянно присутствующие в клетках, и индуцируемые ферменты, биосинтез которых активируется под влиянием соответствующих субстратов. Некоторые функционально взаимосвязанные ферменты образуют в клетке структурно организованные полиферментные комплексы. Многие ферменты и ферментные комплексы прочно связаны с мембранами клетки или её органоидов (митохондрий, лизосом, микросом и т.д.) и участвуют в активном транспорте веществ через мембраны.
Известно более 20000 различных ферментов, из которых многие выделены из живых клеток и получены в индивидуальном состоянии. Первый кристаллический фермент (уреаза) выделен американским биохимиком Д.Самнером в 1926 г. Для ряда ферментов изучена последовательность аминокислот и выяснено расположение полипептидных цепей в трёхмерном пространстве. В лабораторных условиях осуществлен искусственный химический синтез фермента рибонуклеазы. Ферменты используют для количественного определения и получения различных веществ, для модификации молекул нуклеиновых кислот методами генной инженерии, диагностики и лечения ряда заболеваний, а также в ряде технологических процессов, применяемых в лёгкой, пищевой и фармацевтической промышленностях.

Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Вместе с тем биокатализаторы характеризуются рядом специфических качеств, тоже вытекающих из их белковой природы. Эти качества отличают ферменты от катализаторов обычного типа. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность и, наконец, подверженность влиянию активаторов и ингибиторов.
Термолабильность ферментов объясняется тем, что температура, с одной стороны, воздействует на белковую часть фермента, приводя при слишком высоких значениях к денатурации белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает влияние на скорость реакции образования фермент-субстратного комплекса и на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилению катализа.
Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной кривой. До некоторого значения температуры (в среднем до 5О°С) каталитическая активность растет, причем на каждые 10°С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата. В то же время постепенно возрастает количество инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части. При температуре выше 50°С денатурация ферментного белка резко усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного субстрата, падает.
Детальные исследования роста активности ферментов с повышением температуры, проведенные в последнее время, показали более сложный характер этой зависимости, чем указано выше: во многих случаях она не отвечает правилу удвоения активности на каждые 10°С в основном из-за постепенно нарастающих конформационных изменений в молекуле фермента.
Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом.
Температурный оптимум для различных ферментов неодинаков. В общем для ферментов животного происхождения он лежит между 40 и 50°С, а растительного - между 50 и 60°С. Однако есть ферменты с более высоким температурным оптимумом, например, у папаина (фермент растительного происхождения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум находится при 8О°С. В то же время у каталазы (фермент, ускоряющий распад Н 2 О 2 до Н 2 О и О 2) оптимальная температура действия находится между 0 и -10°С, а при более высоких температурах происходит энергичное окисление фермента и его инактивация.
Зависимость активности фермента от значения рН среды была установлена свыше 50 лет назад. Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. Большинство ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной точки. В резко кислой или резко щелочной среде хорошо работают лишь некоторые ферменты.
Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концентрации водородных ионов сопровождается более или менее равномерным падением активности фермента.
Влияние концентрации водородных ионов на каталитическую активность ферментов состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях рН в реакционной среде активный центр может быть слабее или сильнее ионизирован, больше или меньше экранирован соседними с ним фрагментами полипептидной цепи белковой части фермента и т.п. Кроме того, рН среды влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и продуктов реакции, оказывает большое влияние на состояние фермента, определяя соотношение в нем катионных и анионных центров, что сказывается на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так как определенная третичная структура белка-фермента необходима для образования фермент-субстратного комплекса.
Специфичность - одно из наиболее выдающихся качеств ферментов. Эго свойство их было открыто еще в прошлом столетии, когда было сделано наблюдение, что очень близкие по структуре вещества - пространственные изомеры (a- и b-метилглюкозиды) расщепляются по эфирной связи двумя совершенно разными ферментами.
Таким образом, ферменты могут различать химические соединения, отличающиеся друг от друга очень незначительными деталями строения, такими, например, как пространственное расположение метоксильного радикала и атома водорода при 1-м углеродном атоме молекулы метилглюкозида.
По образному выражению, нередко употребляемому в биохимической литературе, фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. Это знаменитое правило было сформулировано Э. Фишером в 1894 г. исходя из того, что специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием геометрической структуры субстрата и активного центра фермента.
В 50-е годы нашего столетия это статическое представление было заменено гипотезой Д. Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента. Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата и активного центра фермента создается в момент их взаимодействия друг с другом, что может быть выряжено формулой “перчатка - рука”. При этом в субстрате уже деформируются некоторые валентные связи и он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки. Гипотеза Кошланда, основанная на допущении гибкости активного центра фермента, удовлетворительно объясняла активирование и ингибирование действия ферментов и регуляцию их активности при воздействии различных факторов. В частности, конформационные перестройки в ферменте в процессе изменения его активности Кошланд сравнивал с колебаниями паутины, когда в нее попала добыча (субстрат), подчеркивая этим крайнюю лабильность структуры фермента в процессе каталитического акта.
В настоящее время гипотеза Кошланда постепенно вытесняется гипотезой топохимического соответствия. Сохраняя основные положения гипотезы взаимоиндуцированной настройки субстрата и фермента, она фиксирует внимание на том, что специфичность действия ферментов объясняется в первую очередь узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и субстратным центром фермента возникают многочисленные точечные гидрофобные взаимодействия и водородные связи.

По строению ферменты могут быть однокомпонентными, простыми белками, и двухкомпонентными, сложными белками. Во втором случае в составе фермента обнаруживается добавочная группа небелковой природы.
В разное время возникли различные наименования белковой части и добавочной группы в двухкомпонентных ферментах. Все они до сих пор употребляются в литературе, например:
Фермент в целом Белковая часть Добавочная группа
Симплекс Ферон (носитель) Агон (активная группа)
Холофермент Апофермент Кофермент
Добавочную группу, прочно связанную, не отделяемую от белковой части, называют простетической группой; в отличие от этого добавочную группу, легко отделяющуюся от апофермента и способную к самостоятельному существованию, обычно именуют коферментом.
Химическая природа важнейших коферментов была выяснена в 30-е годы нашего столетия благодаря трудам О. Варбурга, Р. Куна, П. Каррера и др. Оказалось, что роль коферментов в двухкомпонентных ферментах играют большинство витаминов (Е, К, Q, В1, В2, В6 В12, С, Н и др.) или соединений, построенных с участием витаминов (коэнзим А, НАД+ и т. п.). Кроме того, функцию коферментов выполняют такие соединения, как НS-глутатион, многочисленная группа нуклеотидов и их производных, фосфорные эфиры некоторых моносахаридов и ряд других веществ.
Характерной особенностью двухкомпонентных ферментов является то, что ни белковая часть, ни добавочная группа в отдельности не обладают заметной каталитической активностью. Только их комплекс проявляет ферментативные свойства. При этом белок резко повышает каталитическую активность добавочной группы, присущую ей в свободном состоянии в очень малой степени; добавочная же группа стабилизирует белковую часть и делает ее менее уязвимой к денатурирующим агентам. Таким образом, хотя непосредственным исполнителем каталитической функции является простетическая группа, образующая каталитический центр, ее действие немыслимо без участия полипептидных фрагментов белковой части фермента. Более того, в апоферменте есть участок, характеризующийся специфической структурой, избирательно связывающий кофермент. Это так называемый кофермент связывающий домен; его структура у различных апоферментов, соединяющихся с одним и тем же коферментом, очень сходна. Таковы, например, пространственные структуры нуклеотидсвязывающих доменов ряда дегидрогеназ.
Иначе обстоит дело у однокомпонентных ферментов, не имеющих добавочной группы, которая могла бы входить в непосредственный контакт с преобразуемым соединением. Эту функцию выполняет часть белковой молекулы, называемая каталитическим центром. Предполагают, что каталитический центр однокомпонентного фермента представляет собой уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, располагающихся в определенной части белковой молекулы.
Чаще всего в каталитических центрах однокомпонентных ферментов встречаются остатки сер, гис, три, арг, цис, асп, глу и тир. Радикалы перечисленных аминокислот выполняют здесь ту же функцию, что и кофермент в составе двухкомпонентного фермента.
Аминокислотные остатки, образующие каталитический центр однокомпонентного фермента, расположены в различных точках единой полипептидной цепи. Поэтому каталитический центр возникает в тот момент, когда белковая молекула приобретает присущую ей третичную структуру. Следовательно, изменение третичной структуры фермента под влиянием тех или иных факторов может привести к деформации каталитического центра и изменению ферментативной активности.
Кроме каталитического центра, образованного сочетанием аминокислотных радикалов или присоединением кофермента, у ферментов различают еще два центра: субстратный и аллостерический.
Под субстратным центром понимают участок молекулы фермента, ответственный за присоединение вещества (субстрата), подвергающегося ферментативному превращению. Часто этот участок называют “якорной площадкой” фермента, где, как судно на якорь, становится субстрат. Во многих случаях прикрепление субстрата к ферменту идет за счет взаимодействия с e-аминогрулпой радикала лиз, расположенного в субстратном центре. Эту же роль может выполнять СООН-группа глу, а также НS-группа цис. Однако работы последних лет показали, что гораздо большее значение здесь имеют силы гидрофобных взаимодействий и водородные связи, возникающие между радикалами аминокислотных остатков субстратного центра фермента и соответствующими группировками в молекуле субстрата.
Понятие о каталитическом и субстратном центре не следует абсолютизировать. В реальных ферментах субстратный центр может совпадать (или перекрываться) с каталитическим центром. Более того, каталитический центр может окончательно формироваться в момент присоединения субстрата. Поэтому часто говорят об активном центре фермента, представляющем сочетание первого и второго. Активный центр у ферментов располагается на две щели при двухъядерной структуре, например у лизоцима и рибонуклеазы, или на дне глубокой впадины, как у химотрипсиногена.
Аллостерический центр представляет собой участок молекулы фермента, в результате присоединения к которому определенного низкомолекулярного (а иногда - и высокомолекулярного) вещества изменяется третичная структура белковой молекулы. Вследствие этого изменяется конфигурация активного центра, сопровождающаяся либо увеличением, либо снижением каталитической активности фермента. Это явление лежит в основе так называемой аллостерической регуляции каталитической активности ферментов.
Значения молекулярных масс ферментов колеблются в широких пределах: от нескольких тысяч до нескольких миллионов. В природе насчитывается несколько десятков ферментов, обладающих сравнительно небольшими молекулами (до 50 тыс.). Однако большинство ферментов представлено белками более высокой молекулярной массы, построенными из субъединиц. Так, каталаза (М=25200) содержит в молекуле шесть протомеров с М=42000 каждый. Молекула фермента, ускоряющего реакцию синтеза рибонуклеиновых кислот (РНК-полимераза, М = 400000), состоит из 6 неравных субъединиц. Полная молекула глутаматдегидрогеназы, ускоряющей процесс окисления глутаминовой кислоты (М=336000), построена из 6 субъединиц с М=56000.
Способы компоновки протомеров в мультимеры разнообразны. Крайне важно, что достроенный из субъединиц фермент проявляет максимальную каталитическую активность именно в виде мультимера: диссоциация на протомеры резко снижает активность фермента. Не все ферменты-мультимеры построены исключительно из каталитически активных протомеров. Наряду с каталитическими в их составе отмечены регуляторные субъединицы, как, например, у аспартат-карбамилтрансферазы.
Среди ферментов-мультимеров безусловно преобладают димеры и тетрамеры (их несколько сотен), в меньшей мере распространены гексамеры и октамеры (несколько десятков) и необыкновенно редко встречаются тримеры и пентамеры.
Молекулы ферментов-мультимеров в ряде случаев составлены из субъединиц двух типов, обозначаемых условно как субъединицы типа А и В. Они сходны друг с другом, но отличаются по некоторым деталям первичной и третичной структур. В зависимости от соотношения протомеров типа А и В в мультимере последний может существовать в виде нескольких изомеров, которые называют изозимами. Так, при четырех субъединицах возможны 5 изозимов:
I II III IV V
AAAA AAAB AABB ABBB BBBB
В настоящее время интерес к изозимам резко повысился. Оказалось, что кроме генетически детерминированных изозимов существует большая группа ферментов, обладающая множественными формами, возникающими в результате их посттрансляционной модификации. Множественные формы ферментов и изозимы в частности используются сейчас для диагностики болезней в медицине, прогнозирования продуктивности животных подбора родительских пар при скрещивании для обеспечения максимального гетерозиса в потомстве и т. п.
Значение пространственной организации ферментов особенно ярко выявляется при изучении строения так называемых мультиэнзимов, т.е. ферментов, обладающих способностью ускорять одновременно несколько химических реакций и осуществлять сложные превращения субстрата. Примером может служить мультиэнзим, ускоряющий реакцию окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты. Этот многоферментный комплекс с М=4500000 состоит из трех видов ферментов. Первый из них (E1) ускоряет реакцию декарбоксилирования пировиноградной кислоты. В состав комплекса входит 12 димерных молекул этого фермента (К=19200). Второй и третий ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные процессы при окислении пировиноградной кислоты, сосредоточены внутри мультиэнзимного комплекса. Один из них (Е3) представлен шестью димерными молекулами (М=112 000), другой (Е2) - 24 протомерами (М=70000).
В тех случаях, когда мультиэнзимный комплекс обслуживает единый, многоступенчатый процесс биохимических превращений, его называют метаболоном (от слова метаболизм - обмен веществ). Таковы метаболоны гликолиза, биосинтеза ряда аминокислот, цикла дикарбоновых и трикарбоновых кислот и др.
В результате слаженного во времени и пространстве действия всех трех видов входящих в его состав ферментов мультиэнзим с огромной скоростью осуществляет превращение пировиноградной кислоты. Именно в кооперативном характере каталитического процесса и кроется главное отличие биокатализаторов от катализаторов неорганической природы, именно поэтому интенсивность биокатализа в десятки, сотни и тысячи раз превосходит мощность действия неорганических катализаторов.
Сравнительно недавно выявлена еще одна своеобразная черта в строении ферментов: некоторые из них являются полифункциональными, т.е. обладают несколькими энзиматическими активностями, но всего лишь одной полипептидной цепью. Дело в том, что эта единая цепь при формировании третичной структуры образует несколько функционально и стерически обособленных глобулярных участков - доменов, каждый из которых характеризуется своей каталитической активностью.
При изучении мультиэнзимных комплексов и полифункциональных ферментов удалось понять наиболее важную особенность ферментативного катализа, а именно - эстафетную передачу промежуточных продуктов реакции от одного компонента каталитической системы к другому без их высвобождения.

Ферментология очень долго не располагала строго научной номенклатурой ферментов. Наименования ферментам давали по случайным признакам (тривиальная номенклатура), по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента, наконец, по типу катализируемой реакции и характеру субстрата.
Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких ферментов, как пепсин (от греч. пепсис - пищеварение), трипсин (от греч. трипсис - разжижаю) и папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из сока которого он выделен). По действию все эти ферменты являются протеолитическими, т. е. ускоряют гидролиз протеинов (белков). Характерное название была дано группе окрашенных внутриклеточных ферментов, ускоряющих окислительно-восстановительные реакции в клетке, - цитохромы (от лат. citos - клетка и chroma - цвет).
Наибольшее распространение получила рациональная номенклатура, согласно которой название фермента составляется из названия субстрата характерного окончания -аза. Она была предложена более столетия тому назад, в 1883 г. Э. Дюкло - учеником Л. Пастера. Так, фермент, ускоряющий реакцию гидролиза крахмала, получил название амилаза (от греч. амилон - крахмал), гидролиза жиров - липаза (от греч. липос - жир), белков (протеинов) - протеаза, мочевины - уреаза (от греч. уреа - мочевина) и т. п.
Когда методами аналитической химии были достигнуты известные успехи в расшифровке химической природы простетических групп, возникла новая номенклатура ферментов. Их стали именовать по названию простетической группы, например, геминфермент (простетическая группа - гем), пиридоксаль-фермент (простетическая группа - пиридоксаль) и т.п.
Затем в названии фермента стали указывать как на характер субстрата, так и на тип катализируемой реакции. К примеру, фермент, отнимающий водород от молекулы янтарной кислоты, называют сукцинатдегидрогеназой, подчеркивая этим одновременно и химическую природу субстрата, и отнятие атомов водорода в процессе ферментативного действия.
В 1961 г. Международная комиссия по номенклатуре ферментов представила V Международному биологическому конгрессу проект номенклатуры, построенный на строго научных принципах. Проект был утвержден конгрессом, и новая номенклатура прочно вошла в ферментологию. Согласно этой (Московской) номенклатуре название ферментов составляют из химического названия субстрата и названия той реакции, которая осуществляется ферментом. Если химическая реакция, ускоряемая ферментом, сопровождается переносом группировки атомов от субстрата к акцептору, название фермента включает также химическое наименование акцептора.
Например, пиридоксальфермент, катализируюший реакцию переаминирования между L-аланином и a-кетоглутаровой кислотой, называется L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза. В этом названии отмечены сразу три особенности: 1) субстратом является L-аланин; 2) акцептором служит 2-окcоглутаровая кислота; З) от субстрата к акцептору передается аминогруппа.
Названия ферментов по научной номенклатуре неизмеримо выигрывают в точности, но становятся в ряде случаев гораздо сложнее старых, тривиальных. Так, уреаза (тривиальное название), ускоряющая реакцию гидролиза - мочевины на оксид углерода (IV) и аммиак, по научной номенклатуре именуется карбамид - амидогидролазой. В этом названии дано точное химическое наименование субстрата и указано, что фермент катализирует реакцию гидролиза амидогруппы. Трегалаза, ускоряющая реакцию гидролиза трегалозы, называется трегалоза-1-глюко-гидролазой.
В связи со значительным усложнением научных названий в новой номенклатуре допускается сохранение наряду с новыми старых тривиальных, рабочих названий ферментов. Международной комиссией был составлен детальный список всех известных в то время ферментов, существенно дополненный в 1972 г. при пересмотре как классификации, так и номенклатуры некоторых ферментов, где рядом с новым научным названием каждого фермента приведено старое, а также указан химизм катализируемой ферментом реакции и в некоторых случаях природа фермента. Таким образом, исключается возможность путаницы в наименовании ферментов. В 1964 г. список включал 874 фермента; в последующее время он был существенно дополнен и возрос до 1770 ферментов в 1972 г. и до 2003 ферментов в 1979 г.
Каждому ферменту в указанном списке присвоен индивидуальный номер (шифр). Например, шифр уреазы выражается цифрами 3.5.1.5. Это означает, что уреаза относится к 3-му классу (первая цифра) ферментов, все представители которого катализируют реакции гидролиза. Вторая цифра (5) говорит о том, что уреаза принадлежит к 5-му подклассу этого класса, куда зачислены все ферменты, ускоряющие гидролиз С - N-связей, не являющихся пептидными. Третья цифра шифра (1) указывает на принадлежность уреазы к подподклассу 5-го подкласса, члены которого ускоряют гидролиз линейных амидов, а последняя цифра (5) - порядковый номер уреазы в этом подподклассе.
Упоминавшаяся ранее лактатдегидрогенеза имеет шифр 1.1.1.27, т. е. относится к 1-му классу ферментов (оксидоредуктазы), к 1-му подклассу (оксидоредуктазы, действующие на СН - ОН-группировки в качестве доноров атомов водорода), к 1-му подподклассу (акцептором атомов водорода служит никотинамидадениндинуклеотид) и занимает 27-е место в перечне ферментов упомянутого подподкласса. Таким образом, шифр абсолютно точно указывает место фермента в общем списке. В настоящее время принято в научных публикациях при первом упоминании фермента указывать в скобках его шифр.

По первой в истории изучения ферментов классификации их делили на две группы: гидролазы, ускоряющие гидролитические реакции, и десмолазы, ускоряющие реакции негидролитического распада. Затем была сделана попытка разбить ферменты на классы по числу субстратов, участвующих в реакции. В соответствии с этим ферменты классифицировали на три группы. 1. Катализирующие превращения двух субстратов одновременно в обоих направлениях: А+В)С+D. 2. Ускоряющие превращения двух субстратов в прямой реакции и одного в обратной: А+В)С. 3. Обеспечивающие каталитическое видоизменение одного субстрата как в прямой, так и в обратной реакции: А)В.
Одновременно развивалось направление, где в основу классификации ферментов был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции гидролиза (гидролазы), были изучены ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т. д. Это направление в классификации ферментов оказалось наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших биохимических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности любого организма. По этому принципу все ферменты делят на 6 классов.
1. Оксидоредуктазы - ускоряют реакции окисления - восстановления. 2. Трансферазы - ускоряют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков. 3. Гидролазы - ускоряют реакции гидролитического распада. 4. Лиазы - ускоряют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединяют группы атомов по двойной связи). 5. Изомеразы - ускоряют пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы. 6. Лигазы - ускоряют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей. Эти классы и положены в основу новой научной классификации ферментов.
К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие реакции окисления - восстановления. Окисление протекает как процесс отнятия атомов Н (электронов) от субстрата, а восстановление - как присоединение атомов Н (электронов) к акцептору.
В класс трансфераз входят ферменты, ускоряющие реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков от одного соединения к другому. Это один из наиболее обширных классов: он насчитывает около 500 индивидуальных ферментов. В зависимости от характера переносимых группировок различают фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, трансферазы, переносящие одноуглеродные остатки (метилтрансферазы, формилтрансферазы), и др. Например, амидазы ускоряют гидролиз амидов кислот. Из них важную роль в биохимических процессах в организме играют уреаза, аспарагиназа и глутаминаза.
Уреаза была одним из первых белков-ферментов, полученным в кристаллическом состоянии. Это однокомпонентный фермент (М=480000), молекула его глобулярна и состоит из 8 равных субъединиц. Уреаза ускоряет гидролиз мочевины до NН3 и СО2.
Характерные черты действия ферментов класса лигаз (синтетаз) выявлены совсем недавно в связи со значительными успехами в изучении механизма синтеза жиров, белков и углеводов: Оказалось, что старые представления об образовании этих соединений, согласно которым они возникают при обращении реакций гидролиза, не соответствуют действительности. Пути их синтеза принципиально иные.
Главная их особенность - сопряженность синтеза с распадом веществ, способных поставлять энергию для осуществления биосинтетического процесса. Одним из таких природных соединений является АТФ. При отрыве от ее молекулы в присутствии лигаз одного или двух концевых остатков фосфорной кислоты выделяется большое количество энергии, используемой для активирования реагирующих веществ. Лигазы же каталитически ускоряют синтез органических соединений из активированных за счет распада АТФ исходных продуктов. Таким образом, к лигазам относятся ферменты, катализирующие соединение друг с другом двух молекул, сопряженное с гидролизом пирофосфатной связи в молекуле АТФ или иного нуклеозидтрифосфата.
Механизм действия лигаз изучен еще недостаточно, но, несомненно, он весьма сложен. В ряде случаев доказано, что одно из участвующих в основной реакции веществ сначала дает промежуточное соединение с фрагментом распадающейся молекулы АТФ, а вслед за этим указанный промежуточный продукт взаимодействует со вторым партнером основной химической реакции с образованием конечного продукта.

Одним из принципиальных отличий ферментов от катализаторов небиологического происхождения является кооперативный характер их действия. На уровне одиночной молекулы фермента кооперативный принцип реализуется в тонком взаимодействии субстратного, активного и аллостерического центров. Однако гораздо большее значение имеет кооперативное осуществление реакций на уровне ансамблей ферментов. Именно благодаря наличию систем ферментов - в виде мультиэнзимных комплексов или еще более сложных образований - метаболонов, обеспечивающих каталитические превращения всех участников единого метаболического цикла - в клетках с большой скоростью осуществляются многостадийные процессы как распада, так и синтеза органических молекул. Ферментативный катализ в многостадийных реакциях идет без выделения промежуточных продуктов: только возникнув, они тут же подвергаются дальнейшим преобразованиям.
Это возможно лишь потому, что в клеточном содержимом ферменты распределены не хаотически, а строго упорядоченно. С современной точки зрения клетка представляется высокоорганизованной системой, в отдельных частях которой осуществляются строго определенные биохимические процессы. В соответствии с приуроченностью их к определенным субклеточным частицам или отсекам (компартментам) клетки в них локализованы те или иные индивидуальные ферменты, мультиэнзимные комплексы, полифункциональные ферменты или сложнейшие метаболоны.
Разнообразные гидролазы и лиазы сосредоточены преимущественно в лизосомах. Внутри этих сравнительно небольших (несколько нанометров в диаметре) пузырьков, ограниченных мембраной от гиалоплазмы клетки, протекают процессы деструкции различных органических соединений до тех простейших структурных единиц, из которых они построены. Сложные ансамбли окислительно-восстановительных ферментов, такие, например, как цитохромная система, находятся в митохондриях. В этих же субклеточных частицах локализован набор ферментов цикла дикарбоновых и трикарбоновых кислот. Ферменты активирования аминокислот распределены в гиалоплазме, но они же есть и в ядре. В гиалоплазме присутствуют многочисленные метаболоны гликолиза, структурно объединенные с таковыми пентозофосфатного цикла, что обеспечивает взаимопереключение дихотомического и апотомического путей распада углеводов. В то же время ферменты, ускоряющие перенос аминокислотных остатков на растущий конец полипептидной цепи и катализирующие некоторые другие реакции в процессе биосинтеза белка, сосредоточены в рибосомальном аппарате клетки. Нуклеотидилтрансферазы, ускоряющие реакцию переноса нуклеотидных остатков при новообразовании нуклеиновых кислот, локализованы в основном в ядерном аппарате клетки. Таким образом, системы ферментов, сосредоточенные в тех или иных структурах, участвуют в осуществлении отдельных циклов реакций. Будучи тонко координированы друг с другом, эти отдельные циклы реакций обеспечивают жизнедеятельность клеток, органов, тканей и организма в целом.

Долгое время вполне обоснованно считали, что все ферменты - тела белковой природы. Однако в начале 80-х годов была неожиданно открыта способность низкомолекулярных рибонуклеиновых кислот ускорять реакцию превращения предшественников РНК в функционально значимый продукт, т. е. возникло представление о полирибонуклеотидной природе некоторых ферментов, названных рибозимами.
Хотя уже осуществлен лабораторный синтез ряда ферментов - рибонуклеазы, лизоцима, ферредоксина и цитохрома с, трудно ожидать, что синтетическое получение ферментов получит широкое распространение в ближайшие десятилетия ввиду его сложности и дороговизны, поэтому единственный реальный в настоящее время способ получения ферментов - это выделение их из биологических объектов.
Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод выделения и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит, электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Одна из модификаций адсорбционного метода - афинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюирует с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтажную (аффинная сорбция - элюция) схему выделения.
Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала, вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые несут в своем составе многие индивидуальные ферменты. Особое внимание при выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка, так как она всегда связана с потерей ферментативной активности. Этому способствует проведение операций в присутствии защитных добавок, в частности HS-содержащих соединений (цистеина, глутатиона, меркаптоэтанола, цистеамина, дитиотреитола и др.).
Очень важно поддерживать на всех этапах выделения ферментов низкую температуру, так как некоторые из них даже при -80°С теряют активность.
Для оценки гомогенности ферментного препарата прибегают к обычным методам белковой химии. Переломным моментом в усовершенствовании методов получения высокоочищенных, гомогенных препаратов ферментов было открытие способности их кристаллизоваться, осуществленное впервые в 1906 г. А. Д. Розенфельдом (им была получена в виде кристаллов оксидаза из корней редьки) и приобретшее с 1926 г. широкую известность после работы Д. Самнера по получению кристаллической уреазы из бобов канавалии. Нередко о степени чистоты ферментного препарата судят по его биологической активности; если активность при дальнейшей очистке не возрастает, препарат можно считать гомогенным. Из 2003 включенных в список ферментов более 1500 выделено и в той или иной мере очищено, третья часть их закристаллизована, у нескольких сотен выяснена первичная, а у нескольких десятков - третичная структура.

Ферменты и витамины

Роль биологических молекул, входящих в состав организма.

Лекция № 7

(2 часа)

Общая характеристика ферментов

Строение ферментов

Основные этапы ферментативного катализа

Свойства ферментов

Номенклатура и классификация ферментов

Ингибиторы и активаторы ферментов

Классификация витаминов

Жирорастворимые витамины

Витамины, растворимые в воде

Витамины группы В

Общие признаки ферментов и катализаторов неорганической природы:

Катализируют только энергетически возможные реакции,

Не изменяют направление реакции,

Не расходуются в процессе реакции,

Не участвуют в образовании продуктов реакции.

Отличия ферментов от небиологических катализаторов :

Белковое строение;

Высокая чувствительность к физико-химическим факторам среды, работают в более мягких условиях (Р атмосферное, 30-40 о С, рН близкое к нейтральному);

Высокая чувствительность к химическим реагентам ;

Высокая эффективность действия (могут ускорять реакцию в 10 8 -10 12 раз; одна молекула Ф может катализировать 1000-1000000 молекул субстрата за 1 мин);

Высокая избирательность Ф к субстратам (субстратная специфичность) и к типу катализируемой реакции (специфичность действия);

Активность Ф регулируется особыми механизмами.

По строению ферменты делятся на простые (однокомпонентные) и сложные (двукомпонентные). Простой состоит только из белковой части, сложный (холофермент ) - из белковой и небелковой частей. Белковая часть - апофермент , небелковая - кофермент (витамины В 1 , В 2 , В 5 , В 6 , Н, Q и др.). Отдельно апофермент и кофермент не обладают каталитической активностью. Участок на поверхности молекулы фермента, который взаимодействует с молекулой субстрата - активный центр.

Активный центр образован из остатков аминокислот, находящихся в составе различных участков полипептидной цепи или различных сближенных полипептидных цепей . Образуется на уровне третичной структуры белка-фермента. В его пределах различают субстратный (адсорбционный) центр и каталитический центр. Кроме активного центра встречаются особые функциональные участки - аллостерические (регуляторные) центры.

Каталитический центр - это область активного центра фермента, которая непосредственно участвует в химических преобразованиях субстрата. КЦ простых ферментов - это сочетание нескольких аминокислотных остатков, расположенных в разных местах полипептидной цепи фермента, но пространственно сближенных между собой за счет изгибов этой цепи (серин , цистеин , тирозин , гистидин , аргинин , асп. и глут. кислоты). КЦ сложного белка устроен сложнее, т.к. участвует простетическая группа фермента - кофермент (водорастворимые витамины и жирорастворимый витамин K).

Субстратный (адсорбционный) цент р - это участок активного центра фермента, на котором происходит сорбция (связывание) молекулы субстрата. СЦ формируется одним, двумя, чаще тремя радикалами аминокислот, которые обычно расположены рядом с каталитическим центром. Главная функция СЦ - связывание молекулы субстрата и ее передача каталитическому центру в наиболее удобном для него положении.

Аллостерический центр ("имеющий иную пространственную структуру") - участок молекулы фермента вне его активного центра, который обратимо связывается с каким-либо веществом. Такое связывание приводит к изменению конформации молекулы фермента и его активности. Активный центр либо начинает работать быстрее, либо медленнее. Соответственно такие вещества называют аллостерическими активаторами либо аллостерическими ингибиторами.

Аллостерические центры найдены не у всех ферментов. Они есть у ферментов, работа которых изменяется под действием гормонов, медиаторов и других биологически активных веществ.